簡(jiǎn)述DNA甲基化檢測(cè)

    DNA甲基化是哺乳類動(dòng)物一個(gè)重要的基因外遺傳信號(hào)。有研究表明,DNA甲基化與大多數(shù)腫瘤的發(fā)生相關(guān),抑癌基因啟動(dòng)子CpG島的高度甲基化可引起抑癌基因表達(dá)沉默，細(xì)胞出現(xiàn)無(wú)節(jié)制生長(zhǎng),導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。目前，基因的甲基化研究主要結(jié)合亞硫酸氫鈉處理和PCR技術(shù)，分為甲基化特異性PCR（Methylation specific PCR,MSP）和硫化測(cè)序PCR（Bisulfite sequencing PCR, BSP）。 

 

甲基化特異性的PCR（MSP）原理：

     雙鏈DNA變性解鏈后，在HSO3-作用下發(fā)生C→U轉(zhuǎn)化，C若已有甲基化則無(wú)此改變；甲基化修飾只發(fā)生于5′→3′方向C-G相聯(lián)結(jié)構(gòu)的C上，因此在HSO3-作用后，DNA CpG島若無(wú)甲基化，則序列中的改變?yōu)镃→U，CG→UG，若有甲基化則為C→U，CG→CG，用不同的引物做PCR，即可檢測(cè)出這種差異，從而確定基因有無(wú)CpG島甲基化。從理論上說(shuō)，DNA發(fā)生甲基化的MSP產(chǎn)物的序列與原序列比較，變化為C→T，CG→CG，相應(yīng)其互補(bǔ)鏈的改變?yōu)镚→A，CG→CG。然后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增，zui后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析，確定與引物互補(bǔ)的DNA序列的甲基化狀態(tài)。MSP法靈敏度較高，應(yīng)用范圍廣。

 

硫化測(cè)序PCR（BSP）原理：

    結(jié)合重亞硫酸鹽的測(cè)序法是一種靈敏的能直接檢測(cè)分析基因組DNA甲基化模式的方法。重亞硫酸鹽處理后，用針對(duì)改變后的DNA序列設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。 PCR產(chǎn)物中原先非甲基化的胞嘧啶位點(diǎn)被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位點(diǎn)保持不變。PCR產(chǎn)物克隆后進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)這個(gè)方法能得到特定位點(diǎn)在各個(gè)基因組DNA分子中的甲基化狀態(tài)。

 

甲基化服務(wù)流程：

1）   根據(jù)目的基因啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物；
2）   基因組DNA的提取和定量；
3）   亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA；
4）   修飾后DNA純化回收；
5）   a、結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR的qMSP；
        b、BSP，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并與未經(jīng)處理的序列比較；
6）   數(shù)據(jù)處理；
7）   向客戶提交數(shù)據(jù)分析結(jié)果與實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

 

樣品要求：

    盡可能新鮮和足量的組織（≥50mg）、細(xì)胞樣品（≥106）或全血（≥300μl），或直接提供純化好的DNA（≥5μg/樣品）。

 

基因甲基化檢測(cè)

    甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, SAM）提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶環(huán)的五號(hào)碳原子上加上甲基的共價(jià)修飾過(guò)程.

    DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式，它不改變DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，卻在細(xì)胞的發(fā)育、基因的表達(dá)、及基因組的穩(wěn)定性中起著重要的作用。

    CpG島的高甲基化是腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象，而啟動(dòng)子CpG 島的高甲基化是除突變和缺失外腫瘤中抑癌基因失活的第三種機(jī)制。

    因此，基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)在臨床診斷（如甲基化檢測(cè)與低劑量CT相結(jié)合）、藥物敏感性檢測(cè)等方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

    目前甲基化特異性PCR（Methylmion Specific PCR，MSP）及其改進(jìn)方法是檢測(cè)基因甲基化的經(jīng)典方法．MSP法的原理是首先用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶都被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則不變。然后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增，zui后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析，確定與引物互補(bǔ)的DNA序列的甲基化狀態(tài)。